規(guī)格 PH1421-100 | 100mL
存儲(chǔ) 冰袋運(yùn)輸，-20℃保存
有效期：至少12個(gè)月
試劑組份
試劑A：NP-40 Lysis Buffer----100ml----Store at -20℃
試劑B：PMSF(100mM)----1.5ml----Store at -20℃
產(chǎn)品簡介
NP-40 Lysis Buffer主要由Tris-HCl、NaCl、NP-40等組成。用本裂解液得到的蛋白樣品，可以用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測(cè)定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。
NP-40裂解液 (NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。
使用說明
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。例如取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM，混勻備用 （PMSF現(xiàn)用現(xiàn)加）。
2.去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。
3.按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
4.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
5.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。
2.用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
3.10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
4.進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)組織樣本
1.取NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。
2.取在液氮或超低溫冰箱中冷凍30min以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
3.按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。
4.步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。
5.10000～12000g，4℃離心5～15min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
6.進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事項(xiàng)
1)在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中，去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。
2)如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
3)在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中，如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。
4)如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
5)溶解NP-40 Lysis Buffer時(shí)，應(yīng)盡量縮短溶解時(shí)間，避免裂解液中的有效成分失效。
6)細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或4℃進(jìn)行。
7)為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
*important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.
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